Nuklearna magnetna rezonancija

Nuklearno-magnetno-rezonantna spektroskopija (NMR) je svestrana spektroskopska disciplina koja može da registruje signale atoma iz različitih položaja u molekulu i pri tome da svaki signal dovede u vezu sa nekom od poznatih spinskih interakcija, glavnim izvorima podataka o molekulskoj strukturi i dinamici. NMR spektroskopija je danas, uz rendgeno-strukturnu analizu (kristalografiju rendgenskih zraka), jedina metoda kojom može da se odredi struktura biopolimera sa razlaganjem na atomskom nivou.

Istorijski pregled

NMR spektroskopija, kao eksperimentalna tehnika, poznata je od 1946. godine kada su istraživačke grupe iz Stanforda i sa Harvarda nezavisno uspele da detektuju NMR signal u kondenzovanoj materiji. Za taj pronalazak vodeći istraživači Feliks Bloh i Edvard Mils Parsel dobili su Nobelovu nagradu za fiziku 1952. godine. Nuklearni fizičari su brzo izgubili interes za NMR kada se ispostavilo da opažene NMR frekvencije zavise od hemijske prirode uzorka pa su glavni razvoj metode preuzeli fizikohemičari. Tako je godine 1991. za razvoj Furijeove NMR metode Nobelovu nagradu za hemiju dobio Rikard Ernst iz Instituta za fizičku hemiju ETH, Cirih, a godine 2002. Kurt Vitrih iz Instituta za biofiziku, ETH Cirih, za razvoj NMR metoda za određivanje strukture proteina.

Ništa manje nije burna ni NMR predistorija. Postojanje nuklearnog spina postulirao je Pauli još 1924. godine da bi objasnio hiperfinu strukturu spektralnih linija. Godine 1933. Oto Štern je izmerio magnetni moment protona (atomskog jezgra vodonika) za šta je 1943. godine dobio Nobelovu nagradu za fiziku. A Rabi je 1938. godine izveo prve NMR eksperimente u molekulskim snopovima (dakle, ne u kondenzovanoj materiji) za šta je 1944. i on dobio Nobelovu nagradu za fiziku.^[1]

Fantastična istorija nuklearne magnetne rezonancije doživela je svoj vrhunac 2003. godine kada je Nobelova nagrada za medicinu dodeljena Polu Laterburu i Piteru Mensfildu za otkrića u vezi sa slikanjem mekih tkiva pomoću nuklearne magnetne rezonancije.

Iz razvojnog puta NMR-a može najbolje da se sagleda uloga nauke i njen doprinos civilizaciji. NMR je nastao iz puke radoznalosti, dakle želje fizičara da saznaju nešto više o strukturi atomskog jezgra. Razvoju metode su dosta doprineli hemičari u želji da razumeju strukture organskih molekula. Onda je metoda prodrla u biohemiju za određivanje strukture bioloških makromolekula. Istovremeno je našla mesto u biologiji za nedestruktivno ispitivanje bioloških procesa da bi danas postala nezamenljiva dijagnostička metoda za snimanje mekih tkiva. Godine 1984. Američko udruženje radiologa je, da bi uklonilo asocijaciju na nuklearne reakcije i bombe, iz naziva metode ispustilo nuklearna pa je u medicini NMR poznat kao magnetna rezonancija.^[2]

Osnovne interakcije

„Spin“. Striktno, spin čestice se odnosi na njen sopstveni mehanički moment. Međutim, često se naziv koristi i za česticu kao celinu t. j, za kombinaciju magnetnog i mehaničkog momenta. Spin atomskog jezgra je zbir (ne uvek prost) spinova protona i neutrona koji ulaze u njegov sastav.

Atomska jezgra elemenata sa neparnim brojem protona i/ili neutrona poseduju mehanički moment (spin) i njemu pridruženi magnetni moment. Spin atomskog jezgra, i njemu pridruženi magnetni moment, nisu kuriozitet već fundamentalna osobina protona i neutrona, poput mase ili naelektrisanja. Dakle, magnetni moment atomskog jezgra je univerzalna osobina hemijskih elemenata. Samo jezgra sa parnim brojem protona i parnim brojem neutrona nemaju magnetni moment, recimo ⁴He, ¹²C, ¹⁶O... Međutim, za svaki element sa parnim rednim brojem (parnim brojem protona) može se naći stabilni izotop sa neparnim masenim brojem (neparnim brojem neutrona) iz kojeg se NMR signal može detektovati, na primer, ³He, ¹³C, ¹⁷O...

Nuklearni spin u spoljašnjem magnetskom polju

Van magnetskog polja energija izolovanog nuklearnog spina ne zavisi od njegove orijentacije. To je hipotetička situacija jer su u atomima i molekulima nuklearni spinovi okruženi elektronima. Oko elektrona se prostire magnetsko polje koje potiče od sopstvenog spina elektrona ili od njegovog orbitalnog kretanja. Dakle, u materiji koja nas okružuje nuklearni spinovi se nalaze u magnetskom polju ali se ta interakcija za sve praktične svrhe može zanemariti. Recimo, interakcija nuklearnih spinova sa magnetskim poljem elektrona (ili, ekvivalentno, interakcija elektrona sa magnetskim poljem jezgra) ispoljava se kroz hiperfino cepanje spektralnih linija što se može opaziti samo u specijalnim slučajevima i sa instrumentima vrlo visoke moći razlaganja. Mali je broj hemijskih reakcija (ili prirodnih procesa) čiji ishod zavisi od postojanja nuklearnog spina. U odsustvu spoljašnjeg magnetskog polja nuklearni spin je praktično nevidljiv.

Nuklearni spinovi van magnetskog polja haotično su orijentisani. Spinska magnetna energija jednaka je nuli. U magnetskom polju, spinovi se orijentišu, ali zbog kvantne prirode pojave, samo u smeru polja ili suprotno polju. Zbog toga se i njihov energijski nivo cepa na dva jer paralelna orijentacija ima različitu energiju od antiparalelne.

Unet u magnetsko polje, nuklearni spin se orijentiše, poput magnetne igle kompasa u magnetskom polju zemlje. Zbog kvantne prirode fenomena, moguće su samo diskretne orijentacije čiji je broj definisan spisnkim kvantnim brojem I. Broj orijentacija je 2I + 1; u najjednostavnijem slučaju, kada je I = 1/2, broj orijentacija je 2, pa nuklearni spin može da se orijentiše samo „paralelno“ ili „antiparalelno“ spoljašnjem magnetskom polju. Znaci navoda ukazuju da je takva predstava samo približna. Naime, spin poseduje i mehanički moment, dakle ponaša se i kao čigra. Po analogiji, kao što zemljino gravitaciono polje ne može da obori čigru (dok se okreće) već je samo navodi na precesiono kretanje tako i spoljašnje magnetsko polje ne može potpuno da orijentiše spin već ga navodi na precesiono kretanje. Dakle, u spoljašnjem magnetskom polju spin precesuje oko pravca polja nagnut pod određenim uglom. Pri tome je precesiona frekvencija jednaka rezonantnoj frekvenciji.

Energija spina u spoljašnjem magnetskom polju, kao i kod makroskopskog magnetnog momenta, zavisi od ugla koji spin zaklapa sa poljem. Pošto svakom uglu odgovara određena energija to su i moguća energijska stanja nuklearnog spina podeljena na diskretne, dobro definisane nivoe. Energijska razlika među susednim nivoima zavisi od prirode spinova i jačine (indukcije) spoljašnjeg magnetskog polja. Što je jače polje to je i razlika veća.

Spinski prelazi

Spinovi iz jednog energijskog nivoa u drugi mogu da pređu pod uticajem elektromagnetnih talasa, ali samo ako je energija kvanta elektromagnetnog talasa jednaka energijskoj razlici među nivoima. Iz uslova za jednakost energija (koji se naziva i rezonantni uslov) sledi da, u datom polju, prelaz mogu da izazovu samo elektromagnetni talasi određene frekvencije. Kada se energije poklope onda spin ima jednaku verovatnoću da se nađe u nekom od dozvoljenih stanja, dakle, dolazi do rezonancije. Otuda je i metoda dobila ime nuklearna magnetna rezonancija (NMR)

nuklearna jer se radi o spinovima atomskog jezgra
magnetna jer su u pitanju magnetni prelazi
rezonancija zato što se elektromagnetnim talasima, pri izjednačavanju energija, spinski sistem dovodi u rezonanciju.

Pošto je broj spinova u nižem energijskom nivou veći od broja spinova u višem energijskom nivou (i za spinove važi Bolcmanov zakon raspodele) ukupan rezultat je da prilikom rezonancije dolazi do apsorpcije radiotalasa.

NMR spektar je slika, pri konstantnom spoljašnjem magnetskom polju apsorbovanih talasa, uređena po njihovim frekvencijama. Intenzitet spektralne linije proporcionalan je broju spinova i jačini magnetskog polja.

Energija magnetnog momenta μ u magnetskom polju B₀ (indeks nula se koristi da se naglasi da je u pitanju statičko polje, dakle polje koje se ne menja tokom vremena) izražava se i izračunava na isti način kao i energija makroskopskog dipola u odgovarajućem polju. Ona je jednaka negativnom skalarnom proizvodu vektora polja i momenta, dakle, proizvodu između jačine polja i projekcije dipola na pravac polja (sa znakom minus). U NMR-u se obično uzima da polje B₀ deluje duž z-ose pa je tada

E=-\mu _{z}B_{0}\,

Spinovi u magnetskom polju imaju diskretne energije. Elektromagnetni talasi (fotoni) mogu da izazovu prelaze među spinskim stanjima, i to samo oni čija je energija jednaka energijskoj razlici kod spinova. Uslov za jednakost energija posledica je kvantne prirode (može da se apsorbuje samo ceo kvant).

Zbog kvantne prirode spinskog magnetnog momenta moguće su samo dve orijentacije sa projekcijama μ_z = +μ/2 i μ_z = - μ/2 pa je energijska razlika među spinskim stanjima

\Delta E=\mu B_{0}\,

S druge strane, energija fotona je

\epsilon =\hbar \omega \,

,

gde je $\hbar$ Plankova konstanta a ω njegova (kružna) frekvencija.

Iz rezonantnog uslova (jednakost energije fotona i energijske razlike među spinovima)

\Delta E=\epsilon \,

nalazimo da je frekvencija eletromagnetnog zračenja koje može da izazove rezonanciju, u polju $B_{0}$

\omega ={\frac {\mu }{\hbar }}B_{0}\,

.

Pošto se preko Plankove konstante izražava ugaoni moment čestice (žiroskopski efekat) to se odnos magnetnog i ugaonog momenta naziva žiromagnetni odnos i obeležava se sa γ

\gamma ={\frac {\mu }{\hbar }}\,

Tada se osnovna jednačina NMR-a najčešće piše u obliku

\omega =\gamma B_{0}\,

.

Dakle, rezonantna frekvencija proporcionalna je primenjenom spoljašnjem polju. To je frekvencija koja izaziva rezonanciju u nuklearnom sistemu preko koje detektujemo prisustvo spinova. Vrednosti žiromagnetnih odnosa se od izotopa do izotopa razlikuju, pa je u datom magnetskom polju svaki izotop ima sopstvenu rezonantnu frekvenciju.

Hemijski pomak

Ogoljeno jezgro u spoljašnjem polju B₀ imalo bi rezonantnu frekvenciju ω₀. Međutim pošto je jezgro okruženo elektronima efektivno polje je malko drukčije, B_eff, pa tako i rezonantna frekvencija, ω_eff. U energijskim nivoima to se ispoljava kao promena energijske razlike a u spektru kao pomeranje linije. Pošto osobine elektronskog omotača zavise od hemijskog okruženja to se pomeranje linije pod njegovim uticajem naziva hemijski pomak.

U idealnom slučaju svako atomsko jezgro u homogenom spoljašnjem polju treba da ima samo jednu rezonantnu liniju tačno određene frekvencije. To su bar očekivali fizičari koji su i razvili NMR spektroskopiju da bi ispitivali strukturu atomskog jezgra tačnim merenjima rezonantne frekvencije kod različitih izotopa. Međutim, na njihovo veliko razočarenje, a na (kasniju) radost hemičara, vrlo brzo se pokazalo da položaj spektralne linije, odnosno rezonantna frekvencija, zavisi ne samo od jačine magnetskog polja i vrste jezgra nego i od hemijskog jedinjenja u kome se posmatrano jezgro nalazi. Vrlo brzo je uočeno da je pomeranje spektralne linije pod uticajem hemijskog okruženja, hemijski pomak, posledica zaklanjanja atomskog jezgra orbitalnim elektronima. Elektronske orbitale mogu se zamisliti kao mikroskopske strujne konture koje stvaraju sopstveno magnetsko polje. Zbog toga se stvarno polje na položaju jezgra razlikuje od primenjenog spoljašnjeg magnetskog polja. Lokalno polje zavisi od tipa orbitala, dakle od hemijskog okruženja, i stoga rezonantna frekvencija spina zavisi od njegovog položaja u molekulu. Može se očekivati da molekul pokaže onoliko NMR linija koliko ima atoma posmatrane vrste. Međutim, zbog dodatnih interakcija to se dešava samo u izuzetnim slučajevima (recimo u potpuno reaspregnutim spektrima ¹³C).

Hemijski pomak je proporcionalan spoljašnjem magnetskom polju i zavisno od vrste jezgra iznosi od nekoliko milionitih do nekoliko hiljaditih delova od primenjenog spoljašnjeg polja. Za jezgra vodonika ¹H (protone) pomaci su reda 0 - 10 ppm (ppm = parts per million, lat. delova na milion). a za jezgra ugljenika ¹³C 0 - 240 ppm.

Skalarno sprezanje

Izolovan spin u atomu u kombinaciji spoljašnjeg polja B₀ i lokalnog polja ima rezonantnu frekvenciju ω₀. Međutim u molekulu spinovi su okruženi zajedničkim elektronskim parovima, koji po Paulijevom principu uvek imaju suprotne spinove. Polarizacija (orijentacija) jezgra prenosi se na elektron u njegovoj blizini a preko elektronskog partnera u molekulskoj orbitali i na drugi nuklearni spin. Tako lokalno magnetsko polje oko posmatranog spinazavisi od orijentacije drugog jezgra koje se ne posmatra. Zavisno od orijentacije 'nevidljivog' spina efektivno polje na mestu posmatranog postaje malo veće ili malo manje od polja koje bi tu bilo da 'nevidnjivog'spina nema. U energijskim nivoima to se ispoljava kao promena energijske razlike a u spektru kao pomeranje linije. Pošto otprilike polovina 'nevidljivih' ima jednu ili drugu orijentaciju to je otprilike signal iz polovine posmatranih spinova pomeren ka nižim frekvencijama a druga polovina ka višim. Ukupan efekat je da se prvobitna linija (singlet) cepa na dve (dublet).

U NMR spektrima visokog razlaganja, pored pomeranja, uočeno je i cepanje spektralnih linija. To je bio i dobar i loš znak; dobar, jer je uočena nova interakcija pomoću koje je moglo još nešto da se sazna o detaljima građe molekula, a loš zato što je postalo jasno da su NMR spektri i relativno malih molekula komplikovani za direktno tumačenje. Cepanje NMR spektralne linije opaženo je samo u sistemima sa više spinova iz čega je bilo jasno da je u pitanju spin-spin interakcija. Međutim, pošto se javlja i u izotropnoj sredini (tečnostima), interakcija ne može biti vektorskog tipa. Zbog toga se naziva skalarna interakcija. Takođe, pošto do interakcije dolazi samo između spinova koji se nalaze u istom molekulu, bilo je jasno da su hemijske veze, odnosno elektroni iz molekulskih orbitala, važni posrednici. Zaista, pokazalo se da do skalarne interakcije između dva nuklearna spina dolazi posredstvom elektrona koji ih okružuju. Interakcija je tim jača što je veća verovatnoća da se orbitalni elektron nađe na položaju atomskog jezgra, dakle, interakcija raste sa porastom s-karaktera orbitale. Elektron i sam poseduje spin (dakle ima ugaoni momenat i njemu pridruženi magnetni momenat) koji, kada se nađe dovoljno blizu jezegra, stupa u interakciju sa nuklearnim spinom. Zbog toga energija elektrona zavisi od njegove orijentacije u odnosu na nuklearni spin, i obrnuto, energija nuklearnog spina postaje zavisna od orijentacije elektrona. Kako elektron u zatvorenoj molekulskoj orbitali ima svog partnera sa čijim spinom striktno mora da bude antiparalelan (Paulijev princip), to i spin „udaljenog elektrona“ preko svog elektronskog partnera, oseća interakciju sa posmatranim jezgrom. Istovremeno spin „udaljenog“ elektrona interaguje sa drugim jezgrom, svojim susedom, pa je ukupni efekat da lokalno polje na položaju jednog jezgra zavisi od orijentacije drugog jezgra sa kojim deli elektrone u molekulu.

Na primer, jezgro ¹³C može biti „paralelno“ ili „antiparalelno“ spoljašnjem polju pa svako jezgro, sused kroz hemijske veze, oseća malu promenu lokalnog polja. Za jednu orijentaciju jezgra ¹³C polje je malo veće a za drugu orijentaciju malo manje od vrednosti koju bi imalo da je umesto izotopa ¹³C na istom mestu u molekulu izotop ¹²C, (koji nema spin). Tako se spektralna linija posmatranog spina pomera na jednu stranu kada je ¹³C spin “paralelan“, i na drugu stranu kada je “antiparalelan“ spoljašnjem polju. U NMR eksperimentu uvek se posmatra veliki skup molekula (reda veličine 10¹⁷) pa se za svaku interakciju vidi samo usrednjen efekat. Kako je, zbog izvanredno male interakcije nukelarnog spina sa spoljašnjim magnetskim poljem, verovatnoća da spin ¹³C bude “paralelan“ ili “antiparalelan“ spoljašnjem polju približno ista, to je i ukupni rezultat spin-spin interakcije pojava spektralnih linija (istog intenziteta) koje su simetrično pomerene u odnosu na originalni položaj. Dakle, NMR linija suseda se cepa na dve komponente jednakih intenziteta. Pošto je interakcija reverzibilna, to se i linija ¹³C spina cepa pod uticajem susednog spina. Veličina cepanja je ista za oba partnera a broj komponenata zavisi od broja dozvoljenih orijentacija susednog spina tj., od spinskog kvantnog broja suseda, i po jednostavnoj relaciji 2I + 1. Dakle, za I = 1/2 (¹H, ¹³C, ¹⁵N,...) spektralna linija suseda cepa se na dve komponente, za I = 1 (²H), na 3 itd.

Ako postoji n ekvivalentnih spinova, tada se spektralna linija suseda cepa na 2nI + 1 komponenata. Kada n identičnih protona cepa liniju suseda broj komponenata na koji se linija suseda cepa i relativni intenziteti multipleta mogu da se odrede pomoću Paskalovog trougla:

  n                                    
  0                                    1
  1                                 1     1
  2                              1     2     1
  3                           1     3     3     1
  4                        1     4     6     4     1
 итд.                   1     5    10     10    5     1

Na primer ¹³C linija iz -CH₃ grupe cepa se na kvartet (¹H, I = 1/2, tri spina n = 3), iz -CH₂- grupe na triplet (n = 2) i iz -CH= na dublet. Istovremeno, protonska linija svake grupe, -CH₃, -CH₂- i -CH= je dublet pod uticajem ¹³C spina. Pri tome je cepanje ¹H linije (dakle rastojanje među komponentama dubleta) jednako rastojanju među susednim linijama multipleta u odgovarajućem ¹³C spektru. Veličina cepanja izražena u Hercima naziva se konstanta skalarnog sprezanja. Označava se slovom Ј; ⁿЈ_XY označava da se sprezanje između spinova XY prostire kroz n hemijskih veza; na primer ¹Ј_NC, ³Ј_HH itd. Skalarno sprezanje, po pravilu, opada sa brojem veza i za n > 4 retko se opaža. Ne zavisi od jačine spoljašnjeg polja. Konstanta sprezanja kroz tri hemijske veze, ³J, zavisi od diedralnog ugla koji te veze zaklapaju. Među ekvivalentnim spinovima nema skalarnog sprezanja.

Dakle, skalarna spin-spin interakcija komplikuje spektre povećavajući broj linija ali povećava i broj informacija koje se iz spektra mogu dobiti. Na primer, iz broja komponenata multipleta može da se odredi broj ekvivalentnih spinova na susednoj spinskoj grupi (recimo iz multipletnosti linija ¹³C prouzrokovane sprezanjem ¹Ј_CH mogu da se prepoznaju -CH₃, -CH₂- i -CH= grupe) a iz vrednosti konstante ³Ј mogu da se odrede diedralni uglovi. Skalarna interakcija je kvantne prirode i nema klasičnog analoga; prostire se trenutno.

Dipol-dipol interakcija

Dipol-dipol interakcija, mada u suštini kvantne prirode, može se opisati klasičnim predstavama kao interakcija mikroskopskih magnetnih dipola. Zbog jednostavnosti, posmatrajmo izolovan par spinova sa spinskim kvantnim brojem 1/2. Nuklearni spin se može shvatiti kao mali magnet koji se orijentiše „paralelno“ ili „antiparalelno“ u odnosu na spoljašnje magnetsko polje. Dakle, lokalno magnetsko polje na položaju nekog spina zavisi od geometrijskog rasporeda i orijentacije drugih spinova u njegovoj okolini. Kao što je električni dipol okružen električnim poljem, tako je i magnetni dipol okružen sopstvenim magnetskim poljem. Polje svakog dipola, na rastojanju mnogo većem od dimenzija dipola, obrnuto je proporcionalno trećem stepenu rastojanja od centra dipola. Jačina dipolnog polja zavisi i od ugla koji potez od posmatrane tačke u prostoru do centra dipola zaklapa sa osom dipola. Pošto su dimenzije magnetnih dipola zanemarljivo male u odnosu na rastojanja među njima, geometrijska slika se najlakše može opisati preko međuspinskog vektora. To je vektor koji ima početak na položaju jednog spina a kraj na položaju drugog. Tada se rastojanje među spinovima opisuje intenzitetom međuspinskog vektora a ugao pod kojim se spinovi nalaze jednak je uglu koji taj vektor zaklapa sa spoljašnjim magnetskim poljem. Ako je izolovan spinski par „zamrznut“ tada lokalno polje na položaju jednog spina zavisi od rastojanja među spinovima i ugla koji međuspinski vektor zaklapa sa spoljašnjim magnetskim poljem. Zavisno od orijentacije susednog spina lokalno polje će biti malo jače ili malo slabije od spoljašnjeg polja. Interakcija se prostire kroz prostor, bez obzira na prisustvo hemijskih veza. U makroskopskom uzorku, otprilike polovina spinova se nalazi u malo jačem, a polovina u malo slabijem polju od spoljašnjeg, pošto je broj „paralelnih“ spinova skoro isti kao i broj „antiparalelnih“. Dakle, dipol-dipol interakcija, u odsustvu kretanja (u krutoj rešetki) dovodi do cepanja spektralne linije, pri čemu veličina cepanja zavisi od ugla koji međuspinski vektor zaklapa sa pravcem spoljašnjeg magnetskog polja. Ova interakcija je izvanredno važna za ispitivanje sistema u čvrstom stanju gde su geometrijski odnosi među spinovima konstantni. Recimo, iz zavisnosti cepanja linije od ugla pod kojim je kristal orijentisan u odnosu na spoljašnje magnetsko polje može se odrediti relativan položaj spinova u kristalu kao i njihovo međusobno rastojanje. Međutim, u tečnom stanju dolazi do usrednjavanja lokalnog magnetskog polja usled termalnog rotacionog kretanja. Srednja vrednost lokalnog dipolnog polja jednaka je nuli jer, zbog rotacije molekula, spinski par prolazi kroz sve moguće orijentacije (i one gde je polje malo jače i ono gde je polje slabije) pa se njihovi efekti uzajamno poništavaju. Otuda i cepanje linija, kao posledica statičkog delovanja dipolnog polja, iščezava. Međutim, dipolno polje kretanjem nije uklonjeno već je samo usrednjeno. Stoga se mora uzeti u obzir i dinamički aspekt dipolne interakcije.

Međudelovanje dipola. Nuklearni spin se može smatrati magnetnim dipolom oko kojeg se prostire odgovarajuće magnetsko polje. U spoljašnjem polju B₀ spinovi su diskretno orijntisani i precesuju pa se sa rastojanja mnogo većeg od dimenzije dipola i u vremenu mnogo dužem od precesionog perioda vidi usrednjeno spinsko polje (dole). Tada lokalno polje na položaju posmatranog spina koje potiče od drugoga, zavisi od njihovog međusobnog rastojanja, r, i ugla koji međuspinski vektor zaklapa sa spoljašnjim poljem, Θ. Efektivno polje na položaju spina, B_eff, je zbir spoljašnjeg i lokalnog polja.

Do sada smo smatrali da je stanje spinova nepromenljivo t. j. „paralelni“ spinovi su ostajali paralelni a „antiparalelni“ antiparalelni. Zanemarivali smo mogućnost prelaza između spinskih energijskih stanja. Ranije smo videli da prelaz između spinskih stanja može da se izazove eletromagnetskim poljem (radio-talasima), tačnije, magnetnom komponentom elektro-magnetskog polja. Do prelaza spina iz jednog stanja u drugo (iz „paralelnog“ u „antiparalelno“ i obrnuto) dolazi pod uticajem promenljivog magnetskog polja. Pri tome je važno da frekvencija promenljivog polja odgovara rezonantnoj frekvenciji prelaza i da mu pravac bude normalan na pravac spoljašnjeg polja. Poreklo polja nije bitno. Za vreme snimanja NMR spektra promenljivo polje dolazi iz instrumenta, dakle, spolja. Međutim, prelaze može da izazove i svako drugo promenljivo polje, na primer lokalno polje susednog spina, ali samo ako ima odgovarajuću frekvenciju. Ta frekvencija može poticati od precesije spinova, molekulskog kretanja ili kombinacije frekvencija precesije i kretanja. Jasno da u tečnostima, zbog haotičnog kretanja, molekuli ne rotiraju tačno određenom frekvencijom. U stvari, molekuli rotiraju svim mogućim frekvencijama. Iz detaljnije analize termalnog kretanja zaista sledi da se kretanje može razložiti na čitavo područje frekvencija čiji maksimum zavisi od veličine molekula, temperature i ostalih fizičkohemijskih uslova. Bitno je da u tečnom stanju postoje komponente kretanja i sa frekvencijom koja odgovara rezonantnoj frekvenciji za datu spinsku vrstu. Drugim rečima, lokalno magnetsko polje nuklearnog spina koji se nalazi u molekulu u tečnosti može da ima fluktuacije sa komponentama koje odgovaraju rezonantnoj frekvenciji susednog spina i da tako izazovu kod njega rezonantni prelaz. Očigledno efekat je povratni t. j. ako spin A izaziva prelaz na spinu B onda i spin B može da izazove prelaz na spinu A. Dipol-dipol interakcija, mada usrednjena termalnim kretanjem, nije uklonjena već se samo ispoljava na novi način.

Razmotrimo ukratko tri glavne eksperimentalne manifestacije dipol-dipol interakcije u tečnostima:

a) Relaksacija. To je proces u kojem se sistem (ne mora biti spinski) nakon poremećaja vraća u termalnu ravnotežu, prema Bolcmanovoj raspodeli. Kod sistema sa velikom energijskom razlikom, recimo kod pobuđenih elektronskih stanja, povratak u ravnotežno stanje se obično dešava emitovanjem fotona. Kod nuklearnih spinova verovatnoća za takav prelaz je zanemarljivo mala; zbog vrlo male razlike među susednim energijskim nivoima pobuđena stanja su relativno stabilna. Ipak, svaki spinski sistem se vraća u ravnotežu i bez zračenja, dakle, sistem se relaksira. U toku relaksacije sistem mora da preda višak energije svojoj okolini. (U radijacionom prelazu tu energiju odnosi foton.) Stoga je za relaksaciju neophodno da postoji mehanizam kojim spinski sistem može da razmenjuje energiju sa okolinom. Jedan od najefikasnijih mehanizama je dipol-dipol interakcija modulisana termalnim kretanjem. Iako se kvantitativni opis dobija jedino kvantno-mehaničkim razmatranjem, korišćenjem klasičnih predstava može se dobiti približna slika. Na primer, u konstantnom magnetskom polju, spin menja stanje ako na njega deluje još oscilatorno magnetsko polje čija je frekvencija jednaka rezonantnoj frekvenciji. Kod spinskog para izvor polja je susedni spin a izvor potrebne frekvencije termalno kretanje. Dovoljno je da molekul u kome se nalazi spinski par ima komponente kretanja čija je frekvencija jednaka rezonantnoj da se izazove prelaz. Te komponente su uvek prisutne, jedino je pitanje sa kolikom verovatnoćom. Previše brzo kretanje smanjuje efikasnost dipol-dipol inerakcije za relaksaciju isto kao i previše sporo. Ako se relaksacija jednog spinskog para posmatra kao funkcija temperature onda se nalazi da postoji temperatura pri kojoj je relaksacija najbrža. Iz te zavisnosti može da se odredi pokretljivost molekula jer pri masimalnoj brzini relaksacije komponente kretanja sa frekvencijom jednakom rezonantnoj, imaju maksimalnu verovatnoću. Dakle, iz merenja brzine relaksacije (ili vremena relaksacije) može da se odredi pokretljivost krutog molekula.

b) Širenje spektralne linije. Javlja se kao posledica skraćenja srednjeg života spinskog stanja. Do skraćivanja dolazi usled učestalih prelaza indukovanih fluktuirajućim lokalnim poljem susednih spinova. To dovodi do povećanja neodređenosti njihovih energijskih nivoa odnosno do proširenja područja frekvencija koje mogu da izazovu rezonantni prelaz. Za širenje NMR linija odgovorne su komponente sporog kretanja (dakle, komponente čije frekvencije odgovaraju razlici rezonantnih frekvencija interagujućih spinova). Da bi se ovaj efekat razumeo treba imati u vidu da u spoljašnjem magnetskom polju spinovi precesuju frekvencijom jednakom sopstvenoj rezonantnoj frekvenciji. Sama precesija se može shvatiti kao izvor fluktuirajućeg magnetskog polja. Ako spinovi u spinskom paru imaju potpuno istu rezonantnu frekvenciju onda svaki kod svog suseda može da izazove prelaz sopstvenim lokalnim magnetskim poljem koje je modulisano precesijom. Dva spina iste vrste mogu i bez spoljašnjeg kretanja uzajamno da izazovu energijske prelaze. Pošto ne razmenjuju energiju sa okolinom, spinovi nužno vrše prelaze u suprotnim smerovima; jedan prelazi iz nižeg stanja u više a drugi obrnuto. Ukupan efekat je da spinovi dipol-dipol interakcijom razmenjuju energiju, skraćujući tako vreme života osnovnog i pobuđenog stanja. Ako im rezonantne frekvencije nisu iste, recimo zbog hemijskog pomaka, rezonantni uslov se ipak može ispuniti tako što se razlika u rezonantnim frekvencijama nadoknađuje frekvecijom iz molekulskog kretanja. Efekat je najizraženiji kod velikih molekula jer kod njih sporo kretanje (potrebno da nadoknadi razliku u frekvencijama) ima najveće amplitude, a u malim molekulima se opaža u viskoznim tečnostima ili na sniženim temperaturama.

v) Kros-relaksacija (uzajamna relaksacija). Relaksacija se fenomenološki može shvatiti kao razmena magnetizacije između posmatranog sistema spinova i okoline. U procesu relaksacije, merljiva magnetizacija curi iz sistema i gubi se u okolini. U tom kontekstu, kros-relaksacija se može shvatiti kao razmena magnetizacije među spinovima. Magnetizacija izgubljena na jednom mestu, dakle na jednoj frekvenciji, pojavljuje se na drugom mestu odnosno na drugoj frekvenciji. Treba uočiti da je kros-relaksacija, kao posledica iste dipol-dipol interakcije, u tesnoj vezi sa relaksacijom i širenjem linije. Opisani proces u kome se NMR linija širi zbog uzajamno indukovanih prelaza kod susednih spinova je istovremeno i jedan od važnijih mehanizama za kros-relaksaciju. Ako se svi spinovi na jednoj rezonantnoj frekvenciji selektivno pobude i sistem prepusti samom sebi tada će, zbog uzajamnih interakcija, ta pobuda da se prenese i na spinove, bliske susede. Posmatranjem putanja kojima se magnetizacija sa jedne spinske grupe prenosi na druge dobijamo podatke o molekulskoj geometriji i pokretljivosti molekula. Brzina kros-relaksacije zavisi od pokretljivosti molekula i obrnuto je proporcionalna šestom stepenu rastojanja među spinovima. Jedna od najvažnijih eksperimentalnih manifestacija kros-relaksacije je nuklearni Overhauzerov efekat, NOE. To je pojava da se nakon selektivne perturbacije jedne NMR linije, menja intenzitet druge linije.

Uticaj magnetskog polja na NMR signal

Prema osnovnoj NMR jednačini rezonantna frekvencija je jednaka proizvodu iz žiromagnetnog odnosa i primenjenog spoljašnjeg polja. Dakle, za datu spinsku vrstu, rezonantna frekvencija je proporcionalna polju (ispravnije rečeno, magnetnoj indukciji primenjenog polja). Otuda se svaka promena polja, u prostoru ili vremenu direktno odražava na rezonantnu frekvenciju pa tako i na NMR signal.

Svakom magnetu odgovara jedna rezonantna frekvencija

Da bi došlo do polarizacije (do razvrstavanja po energijskim nivoima) spinski sistem treba da se unese u statičko magnetsko polje, V₀. Tako je magnet u koji se stavlja uzorak jedan od osnovnih delova NMR uređaja. Prvi uređaji su radili na poljima indukcije 0,5 tesla da bi se razvojem tehnologije superprovodnih magneta danas dostigla polja od preko 20 tesla.

NMR u magnetima sa rastućom indukcijom. Sa porastom magnetne indukcije spoljašnjeg polja raste rastojanje između energijskih nivoa zbog čega raste i rezonantna frekvencija i jačina signala.

Ako jedan te isti spinski sistem, recimo čašu vode, unosimo u različita magnetna polja tada će protoni (atomska jezgra vodonika iz vode) u svakom polju da obrazuju uvek dva dobro definisana energijska nivoa. Međutim sa porastom polja opažaju se dve promene:

porast razlike među energijskim nivoima (na crtežu sve duže strelice) kao direktna posledica proporcionalnosti energije magnetnog dipola i magnetne indukcije
porast razlike u naseljenostima energijskih nivoa (na crtežu označeno promenom debljine nivoa) saglasno Bolcmanovom zakonu raspodele.

Ta dva efekta se eksperimentalno ispoljavaju (niko nije video nivoe niti pak prebrojao spinove u njima) kao

porast rezonantne frekvencije sa porastom polja
porast veličine signala sa porastom polja.

Na primer, proton ima žiromagnetni odnos 2,67522212 × 10⁸ s^-1 T^-1, znači, njegova rezonantna frekvecnija sa porstom indukcije od 1 tesla poraste za 267,52 radijana u sekundi ili 42,58 megaherca. U današnjim magnetima, čija se indukcija kreće od pola do 20 tesla, rezonantne frekvencije za protone su u opsegu od 20 do 900 megaherca.

U magnetu sa promenljivom indukcijom frekvecnije su „razmazane“

Ako pak, umesto od magneta do magneta eksperiment izvodimo u jednom magnetu u kojem se polje kontinualno menja s jednog kraja magneta na drugi, tada za mali tačkasti uzorak, rezonantna frekvencija zavisi od položaja uzorka u magnetu.

NMR u jednom magnetu sa rastućom indukcijom. Za homogeni uzorak rezonantna frekvencija zavisi od dela prostora iz kojeg signal potiče. Kako raste indukcija (sleva nadesno), tako rastu i rezonantne frekvencije.

Ako je pak uzorak cilindar čija se osa poklapa sa pravcem duž kojeg se polje menja, tada signal iz svakog segmenta ima sopstvenu frekvenciju i rezultujući signal je „razmazan“ po celom domenu frekvencija. Pri tome sa porastom frekvencije raste i veličina signala.

Odavde odmah uočavamo zanimljivu pogodnost a to je da na osnovu rezonantne frekvecnije možemo da lociramo tačkasti uzorak, ako znamo kako se magnetna indukcija menja unutar magneta. Međutim, eksperiment u magnetu u kojem se polje menja od nule do neke maksimalne vrednosti vrlo je nepraktičan, ponajviše zbog toga što je na niskim frekvencijama signal slab.

U magnetu sa linearno gradijentnim poljem frekvecncije se direktno preslikavaju u odabranu koordinatu

NMR u gradijentu polja. U homogenom polju (levo) za datu spinsku vrstu javlja se jedna rezonantna frekvencija. U linearno gradijentnom polju frekvencije se pomeraju saglasno lokalnom magnetskom polju pa ako je gradijent linearan frekvencije se linearno menjaju duž odabrane koordinate.

Da bi se popravila osetljivost, dakle, da bi signal bio što jači, najbolje je eksperiment izvoditi u magnetu sa što većom indukcijom (na slici levo) kojem se naknadno dodaju mali magneti pomoću kojih se indukcija linaearno menja sa koordinatom oko centralne vrednosti. Dakle, glavnom magnetu se dodaju manji koji u njemu stvaraju gradijent magnetne indukcije. Kao i u prethodnom slučaju, rezonantna frekvencija tačkastog uzorka zavisi od njegovog položaja u magnetu, ali pošto je promena polja s jednog kraja magneta na drugi relativno mala, signal iz svakog dela magneta za dati tačkasti uzorak biće isti. Ako se pak umesto tačkastog koristi uniformni uzorak, cilindar ili kocka, tada će rezonantne frekvencije biti razmazane unutar nekog frekventnog opsega.

Ovde je važno uočiti da je u linerano gradijentnom polju rezonantna frekvencija proporcionalna prostornoj koordinati duž gradijenta, dakle, svakoj koordinati se može pridružiti pripadajuća frekvencija. A NRM signal na datoj frekvenciji zavisi od broja spinova na odgovarajućoj koordinati. Dakle, dolazimo do vrlo zanimljivog otkrića a to je da u NMR eksperimentu u linearno gradijentnom spoljašnjem polju intenzitet signala na datoj frekvenciji odgovara koncentraciji spinova na datoj koordinati. To znači da registrovanjem NMR signala uzorka zatvorenog u crnoj kutiji možemo da utvrdimo koncentraciju spinova u raznim delovima uzorka bez otvaranja kutije. Dakle, pomoću NMR signala iz gradijenta polja možemo da dobijemo raspodelu spinova.

U stvari, u linerano gradijentnom polju dobijamo projekciju spinske gustine (koncentracije spinova duž odabranog pravca. Ovo je bolje nego ništa ali se još ne može nazvati slikom. Međutim, ponovi li se eksperiment sa istim uzorkom pri čemu se uzorak svaki put zarotira za neki mali ugao dobija se serija projekcija pod različitim uglovima iz koje se može rekonstruisati slika, u ovom slučaju Radonovom transformacijom. I tako se dobija NMR slika preseka objekta (u medicini subjekta) koja se kolokvijalno naziva magnetna rezonancija (ili potpuno pogrešno rezonanca).

Za ovu malu igru u gradijentu magnetskog polja Pol Laterbur i Piter Mensfild podelili su Nobelovu nagradu za medicinu 2003.

Magnetne osobine uobičajenih atomskih jezgara

Svaki hemijski element ima bar jedan izotop sa nuklearnim spinom koji bi u principu mogao da se koristi u NMR eksperimentima. Međutim, zbog slabe osetljivosti koristi se relativno mali broj jezgara.

Izotop	Prirodna rasprostranjenost (%)	Spinski broj l	Magnetni moment μ (A·m²)	Električni kvadrupolni (četvoropolni) moment (e×10^-24 cm²)	Frekvencija na 7 T (MHz)	Relativna osetljivost
¹H	99,984	1/2	2,79628		300,13	1
²H	0,016	1	0,85739	2,8 x 10^-3	46,07	0,0964
¹⁰B	18,8	3	1,8005	7,4 x 10^-2	32,25	0,0199
¹¹B	81,2	3/2	2,6880	2,6 x 10^-2	96,29	0,165
¹²C	98,9	0
¹³C	1,1	1/2	0,70220		75,47	0,0159
¹⁴N	99,64	1	0,40358	7,1 x 10^-2	21,68	0,00101
¹⁵N	0,37	1/2	−0,28304		30,41	0,00104
¹⁶O	99,76	0
¹⁷O	0,0317	5/2	−1,8930	−4,0 x 10^-3	40,69	0,0291
¹⁹F	100	1/2	2,6273		282,40	0,834
²⁸Si	92,28	0
²⁹Si	4,70	1/2	−0,55548		59,63	0,0785
³¹P	100	1/2	1,1205		121,49	0,0664
³⁵Cl	75,4	3/2	0,92091	−7,9 x 10^-2	29,41	0,0047
³⁷Cl	24,6	3/2	0,68330	−6,2 x 10^-2	24,48	0,0027

¹H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁹F i ³¹P su jezgra najvažnija za NMR eksperimente:

¹H zbog velike osetljivosti i rasprostranjenosti u organskim jedinjenjima
¹³C jer je ključni sastojak svih organskih jedinjenja
¹⁵N zato što je ključni element u važnim biološkim makromolekulima proteinima i DNK
¹⁹F zbog velike relativne osetljivosti
³¹P zbog česte pojave u biološkim sistemima i dobre relativne osetljivosti

Reference

^ I.I. Rabi, J.R. Zacharias, S. Millman, P. Kusch (1938). „A New Method of Measuring Nuclear Magnetic Moment”. Physical Review. 53: 318. doi:10.1103/PhysRev.53.318.
^ „MRIs and the Perception of Risk”. Steven Goldberg. American Society of Law, Medicine and Ethics. 2007. Arhivirano iz originala 18. 10. 2007. g. Pristupljeno 24. 4. 2009.

Literatura

Bloch, F., Hansen, W. W., and Packard, M. Nuclear Induction. Phys.Rev. 69, 127. 1946.
Purcell, E. M., Torrey, H. C., and Pound, R. V. Resonance absorption by nuclear magnetic moments in solid. Phys.Rev. 69, 37-38. 1946.
Abragam, A.: The Principles of Nuclear Magnetism. Oxford, Oxford University Press, 1961.
Ernst, R.R., Bodenhausen, G., Wokaun, A.: Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions. New York, Oxford University Press, 1987.
Мацура, С.: Рикард Р. Ернст и НМР Спектроскопија. Хем. Преглед. 34, 28-36, 1992

Spoljašnje veze

NMR/MRI tutorial
NMR Wiki Open NMR, EPR, MRI web project

[1] I.I. Rabi, J.R. Zacharias, S. Millman, P. Kusch (1938). „A New Method of Measuring Nuclear Magnetic Moment”. Physical Review. 53: 318. doi:10.1103/PhysRev.53.318.

[2] „MRIs and the Perception of Risk”. Steven Goldberg. American Society of Law, Medicine and Ethics. 2007. Arhivirano iz originala 18. 10. 2007. g. Pristupljeno 24. 4. 2009.

[1]

[2]